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Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒
Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒
Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒

Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒

 详情说明

​Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒

产品货号:ZK-L0597

产品规格:100T


产品简介:

Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒(Hoechst 33258/PI Apoptotis Assay Kit)是一种采用Hoechst 33258和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)双荧光染色方法进行细胞周期与细胞坏死分析的检测试剂盒。单纯的PI染色能够观察DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰,但只能代表G0/G1期发生凋亡,无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡,而且细胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33258可以穿透细胞膜,进入正常细胞和凋亡细胞与DNA结合,能在紫外线下显示蓝色荧光,而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜,对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞,其细胞膜的完整性丧失,PI可以穿透细胞膜使坏死细胞着色产生红色荧光。

Hoechst 33258/PI双染后,可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在二元直方图上,正常细胞对Hoechst33258具有拒染性,呈弱蓝色荧光+弱红色荧光(Hoechst 33258+/PI+);凋亡细胞对Hoechst33258具有嗜染性,呈强蓝色荧光+弱红色荧光(Hoechst 33258++/PI+);坏死细胞对PI具有嗜染性,呈弱蓝色荧光+强红色荧光。本试剂盒亦可用荧光显微镜进行观察,检测细胞含量范围一般为0.1~1×106之间。

 

产品组成:

                           编号

名称

ZK-L0597

100T

Storage

试剂(A): Cell Stain Buffer(2×)

100ml

4℃

试剂(B): Hoechst 33258 Stain

0.5ml

-20℃ 避光

试剂(C): PI Stain

0.5ml

-20℃ 避光

使用说明书

1份

 


自备材料:

胰蛋白酶消化液

流式细胞仪或荧光显微镜

PBS

细胞计数板

 

操作步骤(仅供参考)

1、细胞样品的制备:

⑴贴壁细胞:

①小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。

②用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时,加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,并轻轻吹散细胞。

③收集上述细胞悬液到离心管内,4℃ 1000g离心3~5min,使细胞沉到管底,小心吸取上清并丢弃,可留大约50μl培养液,以免吸走细胞。

④加入约1ml提前预冷的PBS,重悬细胞,并转移至1.5ml无菌离心管,4℃ 1000g离心3~5min,使细胞沉到管底。

⑤小心吸取上清并丢弃,可留大约50μl PBS,以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

⑵悬浮细胞:

①4℃ 1000g离心3~5min,使细胞沉到管底,小心吸取上清并丢弃,可留大约50μl培养液,以免吸走细胞。

②加入约1ml提前预冷的PBS,重悬细胞,并转移至1.5ml无菌离心管,4℃ 1000g离心3~5min,使细胞沉到管底。

③小心吸取上清并丢弃,可留大约50μl PBS,以免吸走细胞,轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。

2、配制Cell Stain Buffer工作液:取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合,即为Cell Stain Buffer工作液,4℃保存备用。

3、重悬细胞:取上述收集好的0.1~1×106细胞,加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液,重悬细胞沉淀。

4、Hoechst 33258/PI染色:

⑴一步法:加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain,轻轻混匀, 置于冰浴或4℃,孵育20~30min。

⑵两步法:

①加入5μl Hoechst 33258 Stain,置于37℃水浴,孵育5~15min

②置于冰水中冷却后,4℃ 1000g离心3~5min,使细胞沉到管底,弃上层染色液。

③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液,重悬细胞沉淀。

④加入5μl PI Stain, 置于冰浴或4℃,孵育20~30min。

5、检测与分析:用流式细胞仪在激发波长400~500nm检测蓝色荧光,在大于630nm处检测红色荧光,同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测,检测前4℃ 1000g离心3~5min沉淀细胞,用PBS洗涤一次,再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测,亦可不收集细胞,弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C),冰浴或4℃染色20~30min。染色后PBS洗涤一次,再在荧光显微镜下观察。

 

染色结果:在蓝色荧光对红色荧光的散点图上,正常细胞呈低蓝光/低红光,凋亡细胞呈高蓝光/低红光,坏死细胞呈低蓝光/高红光。

 

注意事项:

荧光染料都存在淬灭的问题,建议染色后尽快检测。

在为了获得细胞沉淀的离心的过程中,对于特殊细胞,如果细胞沉淀不充分,可以适当提高离心力或延长离心时间。

Heochst 33258与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min以内。太长容易引起Heochst 33258的发射光谱由蓝光向红光迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变。

如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测,则必须把组织消化后,制备成单细胞悬液,才可以进行检测

PI对人体有刺激性,请注意适当防护。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

有效期: 12个月有效。4℃保存,5~6个月有效。

 


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